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2021-07-28
基本原理細(xì)胞凍存時(shí)保存細(xì)胞的最基本方法，當(dāng)不加保護(hù)劑直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成冰晶，從而引起細(xì)胞死亡。因此，正常情況下凍存細(xì)胞，通常會(huì)向培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑，使用逐步降低溫度的方法，以減少凍存過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)冰晶形成、保護(hù)細(xì)胞。注意事項(xiàng)1、凍存細(xì)胞選擇細(xì)胞增殖旺盛、情況穩(wěn)定、無(wú)污染、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。2、實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程必須遵循無(wú)菌操作。3、細(xì)胞凍存液的配方應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的類(lèi)型進(jìn)行調(diào)整，摸索對(duì)應(yīng)細(xì)胞最適的配方。4、細(xì)胞凍存過(guò)程，降溫速率要小，遵循慢凍原則，可借助程序降溫...2021-07-27
41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問(wèn)題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)120mA，45-60min...2021-07-27
Westernblot實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題匯總及處理方案。21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？濃縮膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作WesternBlot嗎？答：分離膠用7％，濃縮膠3.5％，200kd的蛋白不好做。22、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，...2021-07-27
Westernblot實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題匯總及處理方案。1、westernblot的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)答：優(yōu)點(diǎn)：靈敏，特異性高，常規(guī)可達(dá)ng級(jí)，Ecl顯色法理論上可達(dá)pg級(jí)。缺點(diǎn)：通量有限。2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白？答：原因有很多：首先排除WB過(guò)程是不是抗體的問(wèn)題，重新實(shí)驗(yàn)、更換抗體；其次排除蛋白是否降解，提取的時(shí)候需要加入蛋白酶抑制劑，a)你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；最后考慮此種細(xì)胞是否表達(dá)該蛋白，表達(dá)量高低。3、提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？答...2021-07-27
染色質(zhì)免疫沉淀（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而...2021-07-27
分子生物學(xué)主要研究具體生物大分子在某一生物學(xué)行為過(guò)程中的表達(dá)變化、功能和作用方式；主要涉及基因的表達(dá)調(diào)控、蛋白相互作用、信號(hào)分子間的交互對(duì)話(huà)等。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常需要我們?cè)诰唧w實(shí)驗(yàn)前對(duì)所關(guān)注的基因的一些基本信息、可能受哪些因素調(diào)控、與哪些分子可能存在潛在的相互作用，可能參與哪些生物學(xué)行為等進(jìn)行一些初步的判斷，然后根據(jù)這些信息，提出合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。那么，如何獲得上面的這些信息，除了根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供的線(xiàn)索和深入研究相關(guān)文獻(xiàn)以外，還會(huì)用到一些分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)...2021-07-26
RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR），是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA（complementaryDNA，cDNA），再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增?；驹恚河媚孓D(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成與其互補(bǔ)的DNA（cDNA）的過(guò)程。因?yàn)閙RNA末端存在PolyA，所以用OligodT作為通用引物與其互補(bǔ)。商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒里通常除了OligodT之外，...- 純水系列
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